Γιατί το GAPDH χρησιμοποιείται στο Western Blot; + Παράδειγμα

Γιατί το GAPDH χρησιμοποιείται στο Western Blot; + Παράδειγμα
Anonim

Απάντηση:

Το GAPDH χρησιμοποιείται συχνά ως έλεγχος φόρτωσης.

Εξήγηση:

Σε στύπωμα Western χρησιμοποιούμε συχνά GAPDH ως έλεγχο φόρτωσης. Αυτό σημαίνει ότι με την ανίχνευση για το GAPDH μπορούμε να ελέγξουμε ότι έχουμε φορτωμένες ισοδύναμες ποσότητες πρωτεϊνών σε διαφορετικές λωρίδες του στυπώματος.

Ένα παράδειγμα χρήσης - ας πούμε ότι έχουμε μια ασθένεια που πιστεύουμε ότι προκαλεί αύξηση της συγκεκριμένης πρωτεΐνης στο κύτταρο. Θα δημιουργούσαμε ένα δείγμα από "υγιή" κύτταρα και ένα άλλο δείγμα από "άρρωστα" κύτταρα. Στη συνέχεια θα φορτώσαμε ισοδύναμες ποσότητες πρωτεΐνης και των δύο δειγμάτων σε ένα πήκτωμα για το στύπωμα Western.

Μετά την ανίχνευση της κηλίδας για την πρωτεΐνη που μας ενδιαφέρει, διαπιστώνουμε ότι στα νοσούντα κύτταρα το επίπεδο πρωτεΐνης είναι πραγματικά αυξημένο (δηλαδή, μια πιο σκούρα ταινία παράγεται στο στύπωμα). Για να αποδειχθεί ότι αυτή η αύξηση της πρωτεΐνης οφείλεται σε αλλαγή έκφρασης στο κύτταρο, αντί για ένα τεχνητό φορτίο (δηλαδή, η πιο έντονη ζώνη προκαλείται από μια αλλαγή στην έκφραση πρωτεΐνης στα κύτταρα και όχι από εμάς τυχαία φορτώνοντας περισσότερο του δείγματος "νόσου" από το "υγιές") θα διερευνήσαμε επίσης το στύπωμα για το GAPDH για να δείξουμε ότι τα συνολικά επίπεδα πρωτεΐνης είναι τα ίδια και στις δύο λωρίδες.

Επομένως, κάνοντας αυτό δείχνουμε ότι έχει φορτωθεί ισοδύναμη πρωτεΐνη στις δύο λωρίδες και ότι η αλλαγή στην ένταση ζώνης που παρατηρούμε οφείλεται σε μεταβολές στην έκφραση πρωτεΐνης για την πρωτεΐνη που μας ενδιαφέρει.